坦布苏病毒NS1蛋白的原核表达、生物信息学分析及鼠源多克隆抗体制备

李 娜; 林 翠; 吴 诚诚; 张 帆帆; 谭 佳; 黄 江南; 李 海琴; 2025

摘要：目的对坦布苏病毒（Tembusu virus，TMUV）NS1蛋白进行生物信息学分析，原核表达NS1蛋白并制备鼠源NS1多克隆抗体，为TMUV检测及NS1蛋白功能研究提供理论基础。方法使用ProtParam、ProtScale、TMHMM-2.0、SignalP-5.0、NetPhos 3.1、NetNGlyc-1.0、YinOYang-1.2、SOPMA、AlphaFold2等生物信息学软件分析NS1蛋白氨基酸组成、理论等电点、亲/疏水性、跨膜结构域、信号肽、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构。扩增NS1基因，构建重组质粒并转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞表达NS1蛋白。NS1蛋白经尿素处理后使用Ni²⁺-NTA亲和层析纯化并浓缩，随后使用SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。制备鼠源NS1多克隆抗体，建立间接ELISA检测方法，检测鼠源NS1多克隆抗体效价和特异性。结果生物信息学分析结果显示，NS1蛋白编码320个氨基酸残基，分子质量约36.1 kD，理论等电点8.24，为稳定的亲水性蛋白。NS1蛋白不存在跨膜结构域和信号肽，具有42个磷酸化位点（22个丝氨酸位点、17个苏氨酸位点和3个酪氨酸位点）和13个糖基化位点（3个N-糖基化位点和10个O-糖基化位点）。NS1蛋白二级结构中α-螺旋占21.88%，延伸链占25.00%，β-转角占11.87%，无规则卷曲占41.25%，NS1蛋白三级结构由2个结构域组成。成功构建原核表达载体pET-28a-NS1，经纯化后成功获得NS1蛋白。制备的鼠源NS1多克隆抗体经间接ELISA检测效价达1∶3276800，可用于TMUV的特异性检测和间接免疫荧光分析。结论NS1蛋白不含信号肽和跨膜结构域，为亲水性蛋白，适合在原核系统内表达。利用原核表达系统成功构建pET-28a-NS1，通过尿素变性及Ni²⁺-NTA亲和层析纯化后得到纯度和生物学活性较高的NS1蛋白。成功制备效价高、特异性强的鼠源NS1多克隆抗体，可用于TMUV的特异性检测。

关键词： 坦布苏病毒 NS1蛋白 原核表达 多克隆抗体